PCR (polymeraasiketjureaktio) -kokeissa pakkaus voi tuntua yksinkertaiselta, mutta se vaikuttaa suoraan reagenssin stabiilisuuteen, helppokäyttöisyyteen ja luotettaviin tuloksiin. Laboratorion tallentaminen ja kuljettaminen - valmistettujen reagenssien tai kaupallisten esisuunnitelmien, oikeiden PCR -pakkaustekniikoiden hallitseminen voi välttää yleisiä virheitä ja parantaa kokeellista tehokkuutta. Seuraavaksi jaamme käytännön vinkkejä materiaalin valinnasta, pakkausstrategioista ja tallennustiedoista.
I. Pakkausmateriaalin valinta: Yhteensopivuuden ja suojauksen priorisointi
PCR -reaktiot ovat herkkiä lämpötilaan, valolle ja epäpuhtauksille, joten pakkausmateriaalien on täytettävä kolme keskeistä vaatimusta: ilmatiivitys, valo - todistus ja kemiallinen inertti.
Sentrifugiputkien ja PCR -levyjen polypropeenia (PP) on edullinen, koska sen korkea läpinäkyvyys ja DNaasi/RNaasi - vapaat ominaisuudet . 0.2 ml ohut - seinämäiset PCR -putket ovat ihanteellisia nopeaa lämmönsiirtoa varten, kun taas 0,5 ml putket ovat paremmin tasoittuneita reagointeja. 96 - Well PCR -levyä suosittelemme, että valitset hameisen suunnittelun (robottisen manipuloinnin helpottamiseksi) tai ei-skylt-mallin (avaruuden säilyttämiseen).
Tiivistysmenetelmä: Tavanomaiset sentrifugiputket käyttävät litteitä tai korotettuja korkkeja (haihtumisen ja kuivumisen estämiseksi). Kuitenkin pitkälle - termivarastolle - tiivistyskalvo (kuten parafilmi) tai hengittävä kalvo (kuten aeraseal) suositellaan sisäisen ja ulkoisen paineen tasapainottamiseksi. PCR -levyjä suositellaan käyttämään liima -alumiinifoliotiivisteitä (korkea - lämpötilankestävä) tai itse - liimakalvo (yhdelle - -käyttöä).
Valonsuojaus: Reagensseja, jotka sisältävät valoa - herkät aineosat (kuten tietyt väriaineet tai alukkeet), tulisi kääriä alumiinifolioon tai mustia PCR -levyjä (saatavana joiltakin valmistajilta).
II. Elikvoottitekniikat: menetysten minimointi toistuvasta jäädyttämisestä - sulat syklit
Alikvootireagenssit ovat ydinvaihe PCR -pakkauksessa ja vaikuttaa suoraan kokeelliseen toistettavuuteen.
Master Mix -yhdistelmä: Kaupalliset master -seokset (kuten Taq -entsyymit ja DNTP -seos) suositellaan alikvootiksi reaktiotilavuuden plus 5% - 10% marginaalin perusteella (esim. 20 μl: n reaktiolle, alikvootti 22 μl putkea kohti). Vältä suoraan irtotavarasta, koska toistuva jäädyttäminen - -sulkujaksot voivat johtaa vähentyneeseen entsyymiaktiivisuuteen (Taq-entsyymi voi menettää noin 5% aktiivisuuden jäätymistulosjaksoa kohti).
Alukkeita ja malleja: Alukkeita (erityisesti mukautettuja alukkeita) suositellaan alikvootiksi 100 μm: n varastoliuoksista ja tallennetaan - 20 asteeseen. Laimenna työpitoisuuteen (yleensä 0,1–1 μm) ennen käyttöä. Mallit, kuten genominen DNA, tulisi olla yksittäinen - käyttää määriä ristiintaminaation välttämiseksi.
Kontaminaation ehkäisyvinkit: Varmista, että sentrifugiputket ovat kuivia ennen alikvoottia (jäännösetanoli voi estää PCR: ää), pre - viileät pipettivinkit, jotta kylmäreagenssit eivät tartu seinään ja kuluta käsineitä koko prosessin ajan ihon DNA -saastumisen välttämiseksi.
III. Merkintä ja kirjanpito: Vältä "mustan laatikon" ansa
Selkeä merkinnät ovat ratkaisevan tärkeitä PCR -pakkaamiseen; Virheellinen merkintä voi pilata koko kokeen.
Pakolliset merkintätiedot: Reagenssin nimi (esim. "2 × Taq MasterMix"), pitoisuus/sisältö (esim. "10 mm dNTPS"), eränumero (jäljitettävyyden varalta), tallennusolosuhteet (esim. "-20 astetta, joka on suojattu valosta"), Aliquot Date, ja voimassaoloaika (esim. "Käytä 6 kuukauden kuluessa").
Erityismerkinnät: Jos reagenssi sisältää glyserolia (jäätymisaine), väriaineita (esim. SYBR Green) tai lisäaineita (esim. BSA), on annettava lisätietoja (esim. "Sisältää 50% glyserolia, älä säilytä korkeissa lämpötiloissa").
Tallenna synkronointi: On suositeltavaa käyttää laskentataulukkoa tai laboratoriohallintaohjelmistoa (esim. Labguru) kunkin putken sisällön yksityiskohtaiset parametrit (esim. Pohjusekvenssi, TM -arvo) ja yhdistää ne fyysiseen etiketinumeroon.
Iv. Varastointi ja kuljetus: Tasapainotuslämpötila ja fyysinen suojaus
PCR -reagenssien stabiilisuus on erittäin riippuvainen varastointiolosuhteista ja kuljetuksen aikana vaaditaan lisäsuojaa.
Yleinen varastointi:
Entsyymit (taq, käänteistranskriptaasi): pitkä - termi tallennus - 20 astetta (vältä toistuvia jäätymis -sulatusjaksoja; alikvootti ja säilytä -80 asteessa tulevaa käyttöä varten);
Alukkeet/koettimet: Säilytä -20 astetta yli vuoden ajan (jos se sisältää modifioidun ryhmän, kuten biotiini, suojaa valolta);
Non - entsyymipuskurit (esim. PBS): lyhyt - termi tallennus 4 asteessa (enintään 1 kuukausi).
Kuljetusvaatimukset:
Kylmäketjun kuljetuksessa käytä kuivaa jäätä (- 78 astetta) entsyymeille (ylläpidetty alle -20 astetta) ja sinistä jäätä (noin 0 astetta) puskureille lyhytaikaiselle kuljetukselle.
Vältä liiallista värähtelyä (PCR -levyt on kiinnitettävä vaahtolaatikoihin, jotta voidaan estää reagenssien sekoittuminen kaivojen välillä).
Lisää kesän lämpötilan aikana eristävä kerros pakkaukseen (esim. Alumiinifolioeristyspussi + jäädytetty geelipakkaus).
V. Yleiset ongelmat ja ratkaisut
Tehtävä 1: Reagenssin saostuminen (esim. DNTP: t tai Mgcl₂ sademäärä alhaisissa lämpötiloissa) → Liuos: Sentrifugi (1000 rpm, 1 minuutti) ennen alikvoottia. Liukene 37 asteen inkubaattoriin ennen käyttöä ja pyörreke sekoittaen huolellisesti.
Ongelma 2: Levytiiviste kuorii helposti → Ratkaisu: Valitse lämpö - kestävä tiiviste liima -alueella tai käytä lämpötiivistettä (sopii korkeaan - suorituskykykokeisiin).
Ongelma 3: Blurred -tarrat → Ratkaisu: Käytä vedenpitävää merkkiä (kuten Sharpie) tai laseria - tulostusmerkkejä estääksesi alkoholin poistamisen käsinkirjoittamisen.
Johtopäätös
PCR -pakkaus on enemmän kuin vain "pakkaus" reagensseja; Se on ensimmäinen puolustuslinja kokeelliseen luotettavuuteen. Valitsemalla sopivat materiaalit, standardisoimalla eräprosessi, ylläpitämällä perusteellista merkintää ja ylläpitämällä tiukkaa lämpötilanhallintaa kuljetuksen aikana, voit vähentää merkittävästi ihmisen virheitä, varmistamalla vakaampia seuraavia monistusreaktioita ja luotettavampia tuloksia. Muista: Tiedot määrittävät menestyksen. Oikeat PCR -pakkauskäytännöt voivat säästää huomattavaa aikaa vianetsinnästä koko kokeen ajan!